體外細胞毒性試驗是一種在離體狀態(tài)下模擬生物體生長環(huán)境，檢測醫(yī)療器械及生物材料接觸機體組織后所發(fā)生的細胞溶解、抑制細胞生長和其他毒性作用的體外試驗。

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在完成物理和化學性能、加工性能以及外形等有效評價后，醫(yī)療器械生產商需要根據ISO或GB/T規(guī)定的相關標準進行生物相容性評估，將醫(yī)療器械的風險性降至最低。

體外細胞毒性試驗是醫(yī)療器械生物學評價體系中最重要的檢測指標之一，也是醫(yī)療器械及生物材料臨床應用前的必選項目；如一次性醫(yī)用口罩，醫(yī)用透明質酸鈉敷料，牙科種植導板，一次性使用無菌采樣拭子，一次性使用手術衣，一次性穿刺微創(chuàng)擴張器套件，醫(yī)用霧化器等，均需進行細胞毒性試驗以對其安全性進行評估。

目的:評級醫(yī)療器械和生物材料致細胞毒性反應的潛在性，并預測最終生物體應用時的組織細胞反應。通過體外細胞培養(yǎng)技術，可檢測供試品接觸細胞后細胞發(fā)生生長抑制、功能改變、細胞溶解、死亡或其他毒性反應。

意義:可在短時間內較經濟、簡便地篩選出批量供試品的細胞毒性，它為動物試驗的進行與否提供了先決條件，對新型醫(yī)療器械及生物材料的研制和應用提供了重要保證。（）

GB/T 16886.5-2017醫(yī)療器械生物學評價 第5部分：體外細胞毒性試驗

ISO 10993-5:2009 Biological evaluation of medical devices— Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity.

 GB/T 14233.2-2005醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 第2部分：生物 學試驗方法

YY/T 0127.9-2009口腔醫(yī)療器械生物學評價 第2單元 試驗方法 細胞毒性試驗：瓊脂擴散法及濾膜擴散法

體外細胞毒性試驗具有通用性，可以適用于各種醫(yī)療器械和生物材料的評價，試驗主要分三類：浸提液試驗，直接接觸試驗和間接接觸試驗。

選擇哪種方法進行體外細胞毒性試驗，需根據醫(yī)療器械產品的材料，與機體相互作用途徑來選擇。當一個評價項目可用多種試驗方法時，應考慮試驗的原理、靈敏性、可選性、可定量性、重現性、試驗材料的適用性及局限性等因素進行選擇。

例如：

浸提液法適合檢測溶出物的毒性；

直接接觸法對材料的細胞毒性敏感性最高，可檢測出材料微弱的細胞毒性；

間接接觸法中的適合于毒性大的材料檢驗；

以上各種方法因原理不同，各有特點，應根據試驗材料本身理化性質、毒性作用強弱及其用途，正確地選擇試驗方法。

(移出細胞)

細胞種板

使用胰蛋白酶消化培養(yǎng)瓶內細胞，使貼壁細胞懸浮。

將細胞移入離心管，放入離心機，3000rpm離心3分鐘后，去除上清液。

加入培養(yǎng)基配制接種濃度的細胞懸液。

將配制好的細胞懸液接種于96孔板、6孔板或培養(yǎng)皿中，隨后放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，根據標準要求培養(yǎng)對應時長。

(離心)

樣品浸提及換液

無菌操作制備樣品，根據浸提比例加入浸提介質。在37℃下，根據實驗方案浸提24小時或72小時。同時根據標準準備空白對照、陰性對照、陽性對照。

浸提完成后，根據標準用浸提液更換細胞培養(yǎng)液，具體操作如下。

MTT法:棄去原培養(yǎng)液,空白對照組加入空白對照浸提液,陰性對照組加入陰性對照品浸提液,陽性對照組加入陽性對照品浸提液,供試品組分別加入100uL不同濃度的樣品浸提液(100%、75%、50%、25%),換液后放二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24小時。

直接接觸法:棄去原培養(yǎng)液,加入2mL新鮮培養(yǎng)液,將制備好的樣品輕放于中央細胞層上，隨后放入二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24小時。

間接接觸法:按標準要求在培養(yǎng)皿中放入空白對照、陰性對照、陽性對照、樣品浸提液潤濕的濾紙片，二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24小時。

(樣品更換培養(yǎng)液)

結果觀察

(測定吸光度)

MTT法:培養(yǎng)完成，將試驗板置于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。觀察完成后，棄去浸提液,每孔加入50uL質量濃度為1mg/mL的MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2小時。棄去孔內MTT溶液,加入100uL異丙醇,置振蕩器上振蕩10分鐘,在酶標儀570nm和650nm波長下測定吸光度,計算相對增殖率(RGR),根據標準判定樣品是否存在細胞毒性。

直接接觸法:加入樣品培養(yǎng)24小時后,在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、空泡形成、脫落、細胞溶解和膜完整性等,根據標準判定結果。

間接接觸法:加入樣品培養(yǎng)24小時后,顯微鏡下觀察細胞形態(tài),測量褪色面積,根據標準判定檢驗結果。濾膜擴散試驗在此步進行染色。

1）產品原材料本身；

2）產品中含有明顯的細胞毒性，如帶藥物球囊導管、帶涂層的導管導絲；

3）選擇的試驗方法是否適合本產品，如凝膠類、膏狀類、帶顏色液體類產品不適合采用浸提法；灌流器產品，灌流器中的活性炭和吸附樹脂會對吸附含血清培養(yǎng)基中的血清的有效營養(yǎng)成分，導致浸提液中的血清成分不足，這類產品可能不適用于用含血清培養(yǎng)基浸提。

4）產品暴露于浸提介質是否改變pH值，如產品加入浸提介質后，顏色從粉色變成黃色等。

5）帶預沖液產品的處理；

6）環(huán)氧乙烷滅菌后的殘留量；

樣品細胞毒出現陽性并不意味著不能應用于臨床，細胞毒性的結果還應結合其他試驗數據，如材料的物理化學表征、產品組成及預期用途等因素進行綜合評估，當試驗出現毒性結果的時候，可采取進一步評價進行解釋，例如：