試驗方法丨一文了解遺傳毒性試驗——小鼠淋巴瘤細胞TK突變試驗

0 2024-06-28

遺傳毒性試驗是指采用哺乳動物或非哺乳動物細胞、細菌、酵母菌、真菌或整體動物測定試驗樣品是否會引起基因突變、染色體結(jié)構(gòu)畸變以及其他 DNA 或基因變化的試驗。

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檢驗依據(jù)

遺傳毒性試驗的意義

隨著公眾對醫(yī)療器械遺傳效應(yīng)和致癌性的擔(dān)憂不斷增加，遺傳毒性試驗已成為監(jiān)管機構(gòu)對高風(fēng)險醫(yī)療器械的必備要求。它是對醫(yī)療器械安全性的重要評估手段，能夠幫助保障公眾的健康與安全。

宜考慮遺傳毒性試驗的產(chǎn)品

根據(jù)GB/T 16886.1-2022 (ISO 10993-1:2018)，以下幾類接觸風(fēng)險的產(chǎn)品需要考慮進行遺傳毒性檢測：

與黏膜接觸的長期接觸的表面醫(yī)療器械，如：帶針可吸收縫合線

與組織/骨/牙本質(zhì)長期或持久接觸的外部接入醫(yī)療器械，如：銅鎳鈦正畸絲；定制式矯治器

與血液循環(huán)接觸的植入醫(yī)療器械，如：人工血管、封堵止血植入體

血液循環(huán)短期接觸的外部接入醫(yī)療器械，如：一次性使用引流導(dǎo)管及附件；血管鞘組；神經(jīng)血管導(dǎo)絲、透析液過濾器

遺傳毒性試驗策略

遺傳毒性試驗主要用于檢測兩類遺傳損傷：基因突變(點突變)和染色體損傷[結(jié)構(gòu)畸變?nèi)缫孜?、小或大缺失和插入、染色體數(shù)目畸變(非整倍體)]。單一試驗無法檢測出所有相關(guān)遺傳毒性物質(zhì)。如在細菌系統(tǒng)中產(chǎn)生潛在 DNA損傷的試驗材料與它們在真核細胞中的作用可能不具有相關(guān)性，因此，除非進行論證,否則應(yīng)在哺乳動物細胞試驗系統(tǒng)中進行試驗。按照OECD導(dǎo)則通常進行組合體外試驗，組合包括：細菌回復(fù)突變+體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗；細菌回復(fù)突變+體外小鼠淋巴瘤TK試驗；細菌回復(fù)突變+體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗+體外小鼠淋巴瘤TK試驗。下文將詳細介紹遺傳毒性試驗之一——體外小鼠淋巴瘤TK試驗方法的試驗步驟和關(guān)鍵要點。

檢驗依據(jù)

檢驗依據(jù)

GB/T 16886.3-2019 醫(yī)療器械生物學(xué)評價第 3 部分：遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗

ISO 10993-3:2014 Biological evaluation of medical devices -Part 3:Tests for genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity

YY/T 0870.3-2019 醫(yī)療器械遺傳毒性試驗第3部分：用小鼠淋巴瘤細胞進行的 TK 基因突變試驗

體外小鼠淋巴瘤TK試驗方法步驟

復(fù)蘇細胞

從液氮或冷凍柜取出TK細胞迅速解凍復(fù)蘇。樣品浸提：根據(jù)技術(shù)要求制備供試品浸提液。試劑制備：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)配置需要的試劑備用。

接觸處理（0.9%氯化鈉作為介質(zhì)）

無活化組10ml細胞懸液與2ml供試品浸提液以及1mlPBS混合，加入含血清培養(yǎng)基至20ml；活化組取10ml細胞懸液與2ml供試品浸提液以及S9混合液1ml，加入含血清培養(yǎng)基至20ml。置于37°C振蕩培養(yǎng)4h，振蕩頻率為75r/min。

表達、第一天的平板接種效率（PE₀）

短期接觸組接觸4h，長期接觸組接觸24h。

接觸后離心，棄去上清液，用PBS清洗兩遍，調(diào)整細胞濃度為3x10⁵個/ml，置37°C，5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天。

PE₀：取調(diào)整濃度為3x10⁵個/ml的細胞懸液，用含20%血清的RPMI1640培養(yǎng)基梯度稀釋至細胞數(shù)量為8個/ml，接種96孔板，每孔加0.2ml，接種兩塊平板，置37°C，5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)12天。

第二天的平板接種效率（PE₂）、TFT拮抗平板

PE₂：取表達培養(yǎng)結(jié)束后的細胞調(diào)整為3x10⁵個/ml的細胞懸液，用含20%血清的RPMI1640培養(yǎng)基梯度稀釋至細胞數(shù)量為8個/ml，接種96孔板，每孔加0.2ml，接種兩塊平板，置37°C，5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)12天。

TFT拮抗平板：取表達培養(yǎng)結(jié)束后的細胞調(diào)整為1x10⁴個/ml，加入TFT（三氟胸苷，終濃度3μg/ml），混勻，接種96孔板，每孔加入0.2ml，接種兩塊平板，置37°C，5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)12天。

結(jié)果觀察

目視或在顯微鏡及其他適宜用具下觀察計數(shù)各平板無集落生長的孔數(shù)。若試驗組結(jié)果為陽性，宜至少記錄最高濃度陽性組以及陰性對照組和陽性對照組的大小集落數(shù)。若試驗組結(jié)果為陰性，宜記錄陰性對照和陽性對照的大小集落數(shù)。突變集落按大集落(LC:直徑≥1/4孔徑,呈薄層分布,密度低)和小集落(SC:直徑<1/4孔徑,呈塊狀,密度高)分別計數(shù)，極小集落可再繼續(xù)培養(yǎng)3d后計數(shù)。

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